La fragmentation joue un rôle essentiel en spectrométrie de masse. Elle permet d’élucider la structure d’une molécule et de confirmer son identification. Il existe de nombreuses méthodes pour fragmenter un ion, le plus souvent mises en œuvre dans la cellule de collision (MS/MS), mais la fragmentation peut également se produire directement dans la source d’ionisation.
Avant d’aborder les différentes méthodes de fragmentation, il est indispensable de comprendre comment interpréter un spectre de fragmentation (MS/MS). Lorsqu’on observe un tel spectre, on remarque généralement un grand nombre d’ions fragments. Cela peut donner l’impression que chaque ion parent se fragmente en plusieurs morceaux simultanément. En réalité, ce n’est pas le cas.
Dans la majorité des situations, un ion parent se fragmente une seule fois, produisant deux fragments. Dans le cas d’un ion simplement chargé, un seul de ces fragments conserve la charge et devient donc détectable : un seul ion fragment est alors observé pour cet événement de fragmentation.
Pourquoi observe-t-on alors autant d’ions fragments différents sur un spectre MS/MS ? La réponse réside dans la distribution de fragmentation. Le spectre MS/MS est la somme statistique de millions d’événements de fragmentation indépendants.
Imaginons par exemple que l’on sélectionne un million d’ions parents (intensité 10⁶). Parmi eux :
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300 000 ions se fragmentent au site a, produisant un ion fragment A avec une intensité de 3 × 10⁵ (en supposant que la charge reste du côté du fragment A) ;
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500 000 ions se fragmentent au site b, donnant un ion fragment B avec une intensité de 5 × 10⁵ ;
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200 000 ions se fragmentent au site c, produisant un ion fragment C avec une intensité de 2 × 10⁵.
Sur le spectre MS/MS(figure 1), on observera donc plusieurs ions fragments, chacun avec une intensité proportionnelle au nombre d’ions parents ayant subi une fragmentation à cet endroit précis.
Il est important de noter que cet exemple représente un cas idéal. En pratique, l’intensité absolue des ions fragments est souvent plus faible, car une partie des ions parents peut être perdue (neutralisation, fragmentation multiple, pertes hors trajectoire, etc.). En revanche, les intensités relatives des ions fragments sont généralement conservées, ce qui rend le spectre de fragmentation extrêmement informatif pour l’identification structurale.
Les méthodes de fragmentation
Il existe plusieurs méthodes pour fragmenter les ions précurseurs (ions parents). Certaines de ces méthodes conduisent à des mécanismes de fragmentation similaires, produisant ainsi des spectres MS/MS comparables. Elles peuvent être classées selon le mode d’activation des ions parents, notamment en activation vibrationnelle, activation radicalaire et activation à haute énergie.
Activation vibrationnelle
Depuis l’apparition des méthodes d’ionisation douce telles que MALDI et l’électrospray (ESI), l’activation vibrationnelle est devenue la méthode de fragmentation la plus utilisée. Dans ce mode d’activation, les ions absorbent de l’énergie qui est ensuite redistribuée sous forme de vibrations le long de la molécule. L’énergie est donc diffusée sur l’ensemble de l’ion et, si elle est suffisante pour rompre les liaisons les plus faibles, la fragmentation se produit.
L’un des principaux avantages de cette méthode est que la fragmentation est prévisible, ce qui facilite l’interprétation des spectres MS/MS.
Plusieurs techniques permettent de provoquer l’activation vibrationnelle. Les plus couramment utilisées reposent sur des collisions induites. Celles-ci peuvent être obtenues par :
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Collision unique, avec une énergie cinétique de l’ordre de quelques dizaines d’eV. Ce type d’activation est utilisé dans les analyseurs quadripolaires ou dans les cellules de collision (remplaçant le Q2 dans les spectromètres triple quadripôle), ainsi que dans les cellules HCD (Higher-energy Collisional Dissociation) des instruments hybrides couplés à l’Orbitrap. Ces cellules sont similaires à celles des triples quadripôles, bien que le terme HCD soit utilisé pour les distinguer des cellules de type piège ionique présentes dans les mêmes appareils.
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Activation par multi-collisions, typiquement observée dans les pièges à ions. Dans ce cas, les ions parents sont progressivement « chauffés » par de nombreuses collisions avec des molécules neutres présentes dans le piège, avec des énergies cinétiques faibles (environ 1 eV). Les ions accumulent de l’énergie jusqu’à atteindre le seuil nécessaire à la fragmentation.
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IRMPD (Infrared Multiple Photon Dissociation), où l’absorption de photons infrarouges multiples induit une excitation vibrationnelle conduisant à la dissociation de l’ion parent.
Ces différentes méthodes d’activation produisent généralement des spectres MS/MS similaires. En théorie, une différence peut exister entre l’activation par collision unique et l’activation par multi-collisions. En effet, une collision unique peut être réalisée avec une énergie cinétique largement supérieure à l’énergie nécessaire pour rompre une liaison chimique (environ 5 eV). Par exemple, une collision à 20 eV peut entraîner une énergie excédentaire responsable de fragmentations consécutives. En revanche, lors d’une activation par multi-collisions, la fragmentation se produit dès que l’ion parent a acquis l’énergie suffisante, sans excès énergétique significatif. En pratique, toutefois, les activations par collision unique, multi-collisions et IRMPD conduisent majoritairement aux mêmes types de fragments.
Il est important de noter que ce mode d’activation est généralement dirigé par la charge, le plus souvent un proton. La localisation de cette charge joue un rôle déterminant dans le choix des liaisons les plus faibles susceptibles d’être rompues lors de la fragmentation.
Activation radicalaire dans les spectromètres de masse modernes
Dans les instruments modernes, l’activation radicalaire peut être induite de deux manières :
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par ajout d’un électron,
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par retrait d’un électron.
Dans les deux cas, seuls les ions multichargés peuvent être activés efficacement.
Capture d’électron (ECD)
La première expérience d’activation radicalaire contrôlée est la ECD (Electron Capture Dissociation), introduite par McLafferty. Dans cette méthode, des ions multichargés positifs sont bombardés par des électrons de faible énergie cinétique (environ 1 eV). Après la capture de l’électron, l’ion doit se réorganiser pour stabiliser cette charge supplémentaire. Si cette stabilisation n’est pas possible, l’ion se fragmente.
Détachement d’électron (EDD)
Pour les ions multichargés négatifs, l’approche inverse peut être utilisée : l’EDD (Electron Detachment Dissociation). Dans ce cas, un électron est arraché à l’ion par bombardement avec un faisceau d’électrons de plus haute énergie (environ 20 eV). L’ion radicalaire ainsi formé doit soit se réorganiser, soit se fragmenter.
Ces deux méthodes (ECD et EDD) présentent l’avantage de produire des fragments complémentaires à ceux obtenus par activation vibrationnelle. Toutefois, elles restent peu utilisées car elles sont principalement implémentées dans les spectromètres de masse FT-ICR, qui sont moins répandus que d’autres types d’instruments.
Dissociation par transfert d’électron (ETD)
En revanche, l’activation radicalaire par ETD (Electron Transfer Dissociation) est plus largement utilisée. Elle est disponible sur des spectromètres de masse hybrides couplés à un Orbitrap, beaucoup plus répandus que les FT-ICR.
Le principe de l’ETD repose sur la génération préalable d’une espèce radicalaire (atome ou molécule possédant un électron libre). Cette espèce va ensuite transférer son électron à l’ion parent multichargé en phase gazeuse. La capture de cet électron conduit à la formation d’un ion radicalaire excité, qui peut se fragmenter selon des mécanismes caractéristiques de l’activation radicalaire